北海道健康科學大學牙口腔生物學系生理學分部的Takeharu Niioka團隊的研究成果“Involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the parasympathetic vasodilatation of the rat masseter muscle"發表于《Archives of Oral Biology》期刊。該研究聚焦大鼠咬肌，旨在探究三個問題：（1）支配血管的副交感神經是否具有血管活性腸多肽（VIP）免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘導咬肌血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無阿托品存在的情況下，對副交感神經血管舒張的影響。

摘要

已知大鼠咬肌內的血管受副交感神經支配，其血管舒張通過膽堿能和非膽堿能兩種機制實現，但非膽堿能機制尚未明確。近年來，有充分證據表明血管活性腸多肽（VIP）參與了口面部（如下頜下腺和下唇）的副交感神經血管舒張過程，然而關于其在大鼠咬肌中的作用卻知之甚少。本研究以大鼠咬肌為研究對象，開展了以下探究：（1）支配血管的副交感神經是否具有VIP免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘導血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無阿托品存在時，對副交感神經血管舒張的影響。研究發現，在副交感耳神經節和血管周圍的神經纖維這兩個部位均檢測到了VIP免疫反應性；靜脈注射VIP可誘導咬肌血管舒張，且[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能減弱VIP注射引發的血管舒張效應；單獨使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時，無法抑制副交感神經血管舒張，但當[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯合使用時，可降低副交感神經血管舒張效應。這些結果表明：（1）支配咬肌血管的節后副交感神經中存在VIP；（2）靜脈注射VIP可誘導咬肌血管舒張；（3）當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時，VIP可能參與咬肌的副交感神經血管舒張調節。

實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 動物：成年雄性Wistar大鼠（體重260-640g）

2. 試劑：熒光金、無菌生理鹽水、、烏拉坦、泮庫溴銨、4%多聚甲醛、0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.4）、30%蔗糖、1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、VIP抗體、囊泡乙酰膽堿轉運體抗體、Alexa-488標記的驢抗兔IgG抗體、Alexa-568標記的驢抗山羊IgG抗體、熒光素蓖麻凝集素I、VIP、選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP、阿托品

3. 其他：明膠包被玻片

（二）實驗儀器

Hamilton微量注射器、冷凍切片機、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、插管器械

、加熱墊、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

實驗過程

1.動物飼養

實驗大鼠采用12小時光照/12小時黑暗的飼養周期，自由攝食飲水。

2.熒光雙標記法：熒光金逆行運輸結合VIP或VAChT免疫組化

1. 大鼠經腹腔注射麻醉后，在頰部皮膚做小切口暴露咬肌表面，用Hamilton微量注射器向咬肌內垂直注射1μL 2%熒光金，注射速度0.1ml/min，注射后留針2分鐘以防回流。

2. 48-72小時后麻醉大鼠，先以250ml生理鹽水灌注，再用500ml 4%多聚甲醛灌注。

3. 取出耳神經節（OG），浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，用冷凍切片機將其切成40μm切片，對所有切片進行VIP和VAChT免疫組化染色。

4. 染色后將切片置于明膠包被玻片上，用熒光顯微鏡觀察FG標記神經元、VIP及VAChT免疫反應性，計數每個耳神經節切片中同時被FG與VIP或VAChT抗體標記的神經元胞體數量，并計算其占FG標記神經元總數的百分比（每個耳神經節組織制備6-9個切片）。

3.VIP和VAChT的免疫組化染色

1. 取出耳神經節和咬肌，浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，將兩者切成100μm切片，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，在含1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100和0.3%牛血清白蛋白的封閉液中孵育至少3小時。

2. 將切片置于含VIP抗體和VAChT抗體的封閉液中，4℃孵育2天；經磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，再置于含Alexa-488標記的驢抗兔IgG抗體和/或Alexa-568標記的驢抗山羊IgG抗體的封閉液中，4℃孵育1天。

3. 部分咬肌切片僅用VIP抗體和Alexa-568標記的驢抗兔IgG抗體進行免疫組化染色，染色后在4℃下與20mg/ml熒光素蓖麻凝集素I（RCA-I）孵育30分鐘（RCA-I為嚙齒動物血管壁標志物）。

4. 沖洗后將切片置于明膠包被玻片上，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光；對照組實驗通過在孵育液中省略一抗或二抗進行。

4.咬肌血流量（MBF）測量

1. 大鼠吸入誘導麻醉后，腹腔注射烏拉坦維持麻醉，對股靜脈和股動脈進行插管，分別用于藥物注射和監測全身動脈血壓（SABP）。

2. 對大鼠進行氣管插管，靜脈注射泮庫溴銨（初始劑量0.6mg/kg，之后每小時左右補充0.4mg/kg）使其麻痹，通過氣管插管給予50%空氣-50%氧氣混合氣體人工通氣，用加熱墊維持直腸溫度在37℃。

3. 實驗前切斷頸部雙側頸迷走神經和雙側頸上交感干，以排除迷走神經對心血管系統的反射作用及交感縮血管纖維對口面部的影響。

電刺激左側舌神經（LN）的中樞切斷端以誘發咬肌副交感神經反射性血管舒張，使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀監測監測并記錄咬肌血流量變化，通過血流儀圖表上的反應高度量化血流量變化（結果以任意單位表示）。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

(A) 舌神經電刺激（對照組）以及靜脈注射不同劑量血管活性腸肽（VIP，1、10、100 ng/kg）后，局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(B) 靜脈注射 0（僅生理鹽水）、1、10、100 ng/kg VIP 后，局部血流量（MBF）升高幅度的匯總統計（n = 4）。數據以舌神經電刺激（對照組）誘發反應的百分比表示。

(C) 在選擇性血管活性腸肽受體拮抗劑（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽）存在及缺失情況下，注射 100 ng/kg VIP 誘發局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(D) [4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽對 100 ng/kg VIP 誘發局部血流量（MBF）升高效應的影響，以用藥前反應的百分比表示（n = 5）。

5. 分別以0（僅生理鹽水）、1、10、100ng/kg劑量的VIP（溶于生理鹽水）經導管注射，觀察咬肌血流量變化；在注射VIP前20分鐘，持續注射0.1mg/ml的[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP（注射速度2ml/min），觀察其對VIP誘導的咬肌血流量變化的影響。

6. 分別在靜脈注射阿托品（0.1mg/kg）后、持續輸注[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時、同時使用兩種藥物時，電刺激舌神經，將各處理后的數據以處理前（對照）反應的百分比表示。

5.統計分析

所有數據以平均值±標準誤（mean±SEM）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）結合雙側Dunnett檢驗或Tukey校正評估測試反應變化的統計學顯著性，P<0.05視為差異具有統計學意義，數據采用SPSS 16.0軟件（Windows系統）進行分析。

實驗結論

1. 支配大鼠咬肌血管的節后副交感神經中存在VIP免疫反應性，且VIP與囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT，膽堿能標志物）在耳神經節的FG標記神經元胞體及咬肌血管周圍的神經纖維上共定位。

2. 靜脈注射VIP可以劑量依賴方式誘導大鼠咬肌血管舒張，且不影響全身動脈血壓；選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能抑制VIP誘導的咬肌血管舒張，表明VIP可能通過激活咬肌血管壁上的VIP受體發揮血管舒張作用。

3. 單獨使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP無法抑制舌神經電刺激誘發的咬肌副交感神經血管舒張；單獨使用阿托品可使該血管舒張效應降低約36%；而當[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯合使用時，血管舒張效應降低約66%。這表明當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時，VIP可能參與咬肌的副交感神經血管舒張調節。

返回列表